تأثير الكحول على تكوين البروتينات وأنزيمات الليسوزومات في خلايا الكبد
مقدمة
تشمل طرق دراسة الأيض (البناء والهدم) في الكبد استخدام الكبد المفصول المفعم ، شرائح الكبد، متجانس الكبد وكذلك معلقا من خلايا الكبد السليمة والتي قد تكون على شكل طبقة واحدة أو خلايا مزروعة في وسط معين. وهناك براهين مقنعة بأن معلقا من خلايا الكبد الحية تستطيع أن تستمر في القيام بوظائفها بطريقة طبيعية لمدة تتراوح بين 10- 20 ساعة. ومن هذه الوظائف بناء الجلايكوجين والكربوهيدرات (2، 3، 4) والدهنيات (5، 6) وكذلك بناء البروتينات (7، 8).
وقد أشارت دراسات مختلفة في السنين الأخيرة بأن الكحول الأثيلي يفسد عمليات أيض البروتينات في الكبد. فقد ورد في عدد من التقارير بأن كمية البروتين الكلية (9، 10) وكذلك مستوى البروتين في الميكروسومات (11، 12) ازدادت في أكباد الحيوانات والتي أعطى لها الكحول لزمن طويل.
وقد أوضح عدد آخر من الباحثين (13، 14، 15) بأن الكحول تسبب نقص الكمية الإجمالية لتكوين البروتينات في الكبد
وقد أوضحت أبحاث سابقة (16،17) بأن إعطاء الجرذان كحولا لمدة طويلة يسبب نقصا الأنزيمات المرتبطة بالأغشية الخلوية كالأنزيم الذي يكسر ثلاثي فوسفات الأدينوسين في الميتوكوندريتا وكذلك الأنزيم الذي ينقل مجموعة الأسيل بين مركب كارنتين واسيل كوأ في الكبد. أما تأثير الكحول على أنزيمات الليسوزومات في الكبد فلم تتوفر أية معلومات سابقة عن ذلك. ولقياس تأثير الكحول على أنزيمات الليسوزومات في الكبد وتفادي إعطاء الكحول للحيوانات في الأكل فقد استخدمت طريقة أبسط وهي خلايا كبد مفصولة ومعلقة في وسط مركب معين.
ولهذا فإن الغرض من الدراسات المدونة في هذا المقال هو معرفة تأثير الكحول الأثيلي على أنزيمات الليسوزومات في خلايا الكبد. وهذه الدراسات مرتبطة كذلك بدراسة بناء وتكسير البروتينات في الكبد.
المواد والطرق التجريبية
الموا د:
استخدمت جرذان من نوع (Sprauge Dawty) كمصدر لاستئصال الكبد وتحضير الخلايا منه. وقد تم الحصول على المواد التالية من شركة (Sigma): الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأكسجين (DNA) نوع 7، الحامض النووي الرايبوزي (RNA) نوع 3، 3- نيترات الفنيل الفوسفاتي ثنائي الصوديوم . أما بقية المواد الكيماوية المستخدمة في هذه الدراسة فقد كانت من نوعية نقية للتجارب.
تحضير خلايا الكبد:
استخدمت جرذان مؤنثة أو مذكرة من أعمار تتراوح بين 60- 70 يوما كمصدر للحصول على الكبد. وقد تم تحضير خلايا الكبد بتعديل بسيط على طريقة استخدام الأنزيم الذي يكسر الكولاجين في الكبد المفعم كما أورد بيري وفرند (18) وسيجلين (8). والأجهزة التي استخدمت في إفعام الكبد مشابهة لتلك التي وصفها ويجل وانجبريتسين .
وقد تم إفعام الكبد مبدئيا عن طريق الوريد الكبدي البوابي بمحلول هانكس المضاف إليه ما يلي: مادة هيبيز(Hepens) بتركيز جزيئي يعادل 25، 0، زلال مصل الأبقار بتركيز 5. 1% وسكر الجلوكوز بنسبة ا،.%. وكان محلول الإفعام يغذى بالأكسوجين بشكل مستمر في جو يحتوي على 95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون. أما حامضية المحلول فقد تم ضبطها على 4, 7 باستخدام بيكربونات الصوديوم بتركيز جزيئي يعادل ه،. وبعد نقل الكبد إلى خزانة مخصصة وفي درجة حرارة معينة تم تغيير المحلول المستخدم بمحلول آخر يحتوي على الأنزيم الذي يكسر الكولاجين بتركيز يعادل 4، 0% وذلك مادة محبطة لأنزيم التريبسين بتركيز يعادل 8..،%، واستمر إفعام الكبد بهذا المحلول لمدة 15 دقيقة حتى بدأ الكبد يتفتت. وبعدها تم جمع الخلايا ورشحت من خلال قماش نيلون للتخلص من الأنسجة الرابطة أو الأغشية. وبعدها تم تمخيض الخلايا على سرعة 55 تسارع لمدة دقيقتين ومن ثم أعيد خلط الخلايا المترسبة في كمية جديدة من محلول هانكس على درجة حرارة 4 م وغسلت الخلايا مرة أخرى في محلول هانكس ومرة أخيرة في محلول سويم (Swims) المضاف إليه ما يلي: 10% مصل العجل ومادة هيبز بتركيز جزيئي يعادل 25.، وبنسلين بتركيز 100 وحدة لكل مليمتر وسكر جلوكوز بتركيز جزيئي يعادل 007، وترايسين بتركيز جزيئي يعادله50 0، وبعد هذا كله خلطت الخلايا في محلول سويم بتركيز مليوني خلية لكل ملليمتر.
ولمنع التلوث بالجراثيم فقد تم تعقيم جميع الزجاجيات والأدوات المستخدمة في جهاز تعقيم بخاري على درجة حرارة 110 م لمدة 25 دقيقة. أما المحاليل المستخدمة ومحلول الأنزيم الذي يكسر الكولاجين فقد تم تعقيمها بطريقة الترشيح خلال أغشية ذات ثقوب دقيقة (25،. ميكروميتر).
أما نسبة سلامة الخلايا فقد تم تقديرها بطريقتين:
أ) استثناء صبغة، ترايبان (Trypan) الزرقاء .
ب) النسبة المئوية لتسرب أنزيم مختزل اللاكتيت (Lactate dehydrogenase) إلى الوسط المزروع (20، 21) .
شروط حضانة الخلايا:
لأغراض دراسة أنزيمات الليسوزومات استخدمت صحون لزراعة الخلايا ذات حجر متعددة (24 حجرة لكل صحن ومساحة لحجرة تساوي 2 س). وأضيف لكل حجرة في هذا الصحن مليليتر واحد من معلق الخلايا (مليوني خلية) وبعدها أضيفت الكمية المطلوبة من الكحول الأثيلي . ووضعت هذه الصحون في حاضنة على درجة حرارة 37 م وفي جو من 95% هواء و 5 % ثاني أكسيد الكربون وتمت المحافظة على حامضية الوسط الزراعي ما بين 7.3-7.4. ولأخذ عينات من هذه الخلايا لإجراء التحليلات المطلوبة عليها أخذت محتويات حجرات معينة بواسطة ماصة بعد فترات زمنية محدده وتم تجميدها ، وعندما يراد تحليل هذه العينات تذاب وتعرض لأمواج صوتية لتكسيرها إما لأغراض قياس كمية اندماج الحامض النووي في البروتينات فقد أخذ ما يعادل أربعة مليمترات من معلق الخلايا ووضعت في
صحن بيتري قطلره 60 مليميتر. ثم أضيف الحامض الأميني المشع لوسين لهذه الخلايا بتركيز يعادل 10 ميكروكيوري لكل مليليتر وبعد ذلك أخذت عينات في أوقات معينة لتحليلها.
ء طرق التحليل،:
تم قياس فعالية ثلاثة من أنزيمات الليسوزومات في الوسط الذي زرعت فيه الخلايا بعد تكسيرها. تم قياس كل من الأنزيم الذي يكسر الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأكسجين (DNAase) والأنزيم الذي يكسر الحامض النووي الرايبوزي (RNAase) وذلك بتعديل بسيط على الطريقة التي وصفها ديدوف ورفاقه وفاس وجاكوس (23، 24) وكل وحدة من هذين الأنزيمين تعمل على تكسير ميكرومود واحد من الحامض النووي الرايبوزي أو الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأكسجين لمدة ساعة على درجة حرارة 37 م.
أما الأنزيم الذي يفصل جزئي الفوسفات في وسط حامض فقد تم قياسه بتعديل الطريقة التي وصافها نيل وهورنر. وكل وحدة من هذا الأنزيم تعمل على تحليل ميكرومول واحد من 3- نيترات الفنيل الفوسفاتي في مدة نصف ساعة وفي درجة حرارة الغرفة. وأما كمية البروتين فقد تم تعيينها بواسطة طريقة لوري ورفاقه واستخدام زلال مصل الأبقار كمعيار. وتم قياس كمية اندماج الحامض الأميني كما ذكر في طريقة سابقة مدونة .
النتائج
اندماج الحامض الأميني في بروتينات خلايا الكبد:
يمثل شكل اندماج الحامض الأميني المشع لوسين في البروتينات وذلك لمدة 10 ساعات. وفي هذا الشكل يتضح أن خلايا الكبد قامت بدمج الحامض الأميني المشع في بروتينات الكبد بسرعة ثابتة تقريبا. وعند إضافة الحامض الأميني المشع لخلايا الكبد الضابطة والي تم وضعها في الحاضنة لمدة ساعتين مسبقا تبين أن سرعة اندماج الحامض الأميني المشع مساوية لتلك السرعة في الخلايا التي تم تحضيرها حديثا مما يدل على أن قابلية خلايا الكبد لبناء البروتينات لا تتغير أثناء وضعها في الحاضنة.
وقد أدت إضافة الكحول للخلايا إلى نقص في قابلية الخلايا على دمج الحامض الأميني المشع في البروتينات. ويتناسب هذا النقص تناسبا طرديا مع تركيز الكحول الأثيلي . فمثلا تسبب الكحول لترك بتركيز جزيئي يساوي 30% بينما الكحول بتركيز جزيئي 10.، تسبب في نقص يساوي 20 %.. أنه بعد إضافة الحامض الأميني المشع لخلايا الكبد ووضعها في الحاضنة لمدة ساعة بدأ ظهور بروتينات مشعة في الوسط الذي زرعت فيه الخلايا وبعد وضع الخلايا في الحاضنة لمدة عشر ساعات كانت كمية البروتينات المشعة في الوسط الذي زرعت فيه تمثل حوالي 50% من مجموع الكمية المشعة التي اندمجت في البروتينات ووجود الكحول الأثيلي في الوسط الزراعي تسبب في نقص نسبة البروتينات المشعة التي تظهر في الوسط الذي زرعت فيه الخلايا. والنقص في نسبة البروتينات المشعة يعتمد كذلك على تركيز الكحول الأثيلي. فالكحول بتركيز جزيئي يعادل50.، تسبب في نقص 40% من البروتينات المشعة بينما تسبب الكحول بتركيز حزيئي 010، إلى نقص 25% فتمط.
ويبدو أن تأثير الكحول على اندماج الحامض الأميني المشع يتم بواسطة المشتق أسينالدهايد والناتج تكسل الكحول الأثيلي . فإن إضافة أسيتالدهايد إلى معقل خلايا الكبد قد تسبب في تأثير مماثل لذلك الذي سببه الكحول. قد نتج عن إضافة أسيتالدهايد بتركيز جزيئي يعادل 1001 نقص يساوي 40 % في اندماج الحامض الأميني المشع .
تأثير تركيزات مختلفة للكحول الأثيلي على أنزيمات الليسوزومات.
يمثل تأثير ثلاثة تراكيز مختلفة للكحول الأثيلي على فعالية أنزيمات الليسوزومات. وفي هذا الجدول يتضح أن جميع التراكيز المستخدمة تسببت في خروج كمية هامة من الأنزيمات من خلايا الكبد إلى الوسط الذي زرعت فيه. فالكحول الأثيلي بتركيز مرتفع (.5.،) تسبب في خروج كميات كبيرة من الأنزيمات تعادل 30% من الكمية الكلية لهذه الأنزيمات. ومع أن خروج هذه الأنزيمات كان على شكل تدريجي إلا أن الكمية العظمى خرجت بعد ساعتين من وضع الخلايا في الحاضنة. فعند استخدام الكحول الأثيلي بتركيز ما يعادل 20% من الأنزيمات في خلال ساعتين . أما الكميةالإجمالية لفاعلية الأنزيمات فلم تتأثر بإضافة الكحول الأثيلي .
أما مشتق الكحول الأثيلي أسيتالدهايد ، فلم يسبب أي تأثير على فعالية أنزيمات الليسوزومات حتى إنه عند إضافة أسيتالدهايد بتركيز جزيئي يعادل 001 , لم يسبب زيادة واضحة في فعالية أي من أنزيمات الليسوزومات الثلاث والتي تم تحليلها في هذه الدراسة .
مناقشة
توضح النتائج في هذه الدراسة أن الكحول الأثيلي بتركيز يمكن الحصول عليه بسهولة في الجسم يسبب نقصا في بناء البروتينات في خلايا الكبد. وبسبب استخدام خلايا الكبد المفصولة في هذه الدراسة فإنه يمكن استبعاد تأثير الكحول الأثيلي على دخول المواد الأولية إلى الخلايا أو تكسير البروتينات.
وتدل هذه الدراسة على أن الكحول الأثيلي قد يؤثر تأثيرا مباشرا عام بناء البروتينات وليس عن طريق الهرمونات أو عوامل خارجة عن الكبد قد تكون موجودة في الغذاء. وتتفق نتائج هذه الدراسة مع نتائج بيرن ورفاقه والتي حصلوا عليها باستخدام شرائح للكبد. أما في الكبد المفعم وفي الجسم فإن الكحول الأثيلي يسبب نقصا في اندماج الأحماض الأمينية في البروتينات التي تخرج إلى الدم بينما يتمل تأثيره على البروتينات التي تبقى في الخلية. وتوحي الملاحظات التي وردت في الدراسة الحالية على أن الكحول الأثيلي لا يؤثر على دخول الحامض الأميني المشع لوسين إلى الخلية. وإنما يؤثر على كمية اندماج هذا الحامض الأميني بالبروتينات حيث ينتج نقصا في ذلك يتراوح بين 20- 40% عند إضافة الكحول الأثيلي بتركيز جزيئي يتراوح بين 10.،-50., .
ويبدو أن تأثير الكحول الأثيلي على بناءالبروتينات ناتج عن أيض الكحول نفسه وتكوين المشتق اسيتالدهايد. وتتفق هذه النتائج مع نتائج سابقة مدونة. أما الميكانيكية التي يعمل بها أسيتالدهايد وكذلك كثيرا من الألدهايدات الأليفانية على بناء البروتين فما تزال غير واضحة. وقد ذكر الباحثون في السابق أن الألدهيدات الأليافاتية تتحد مع الأحماض الأمينية التي تحتوي على مجموعة نشطة مجاورة للمجموعة الأمينية كما هو الحال في الأحماض الأمينية سيرين وثريونين وسستين . بالإضافة إلى ذلك فقد ذكر الباحثون أن اسيتالدهايد يتكثف مع الحامض الأميني جلايسين ويكون ثريونين أو الوثريونين وذلك بوجود الأنزيم المناسب (30).
وتدل هذه الدراسة على أن الكحول الأثيلي يسبب تسربا في أنزيمات الليسوزومات من-خلايا الكبد إلى الوسط الذي تزرع فيه ولذلك فإنه بديهي أن يؤثر الكحول الأثيلي عند وجوده في الجسم على خروج هذه الأنزيمات إلى السيتوبلازم ومن ثم إلى الوسط الذي يحيط بالخلايا وخروج هذه الأنزيمات من الليسوزومات هو نتيجة لتأثير الكحول الأثيلي المباشر على غشاء الليسوزومات. ولا يثير هذا الاستنتاج الدهشة حيث أن الكحول الأثيلي قد يسبب إذابة الدهنيات الموجودة في غشاء الليسوزومات. كذلك فإن إضافة مشتق الكحول الأثيلي أسيتالدهايد إلى خلايا الكبد لم يؤثر على أنزيمات الليسوزومات. ومع أنه يتم متابعة بناء الحوامض النووية الرايبوزي والرايبوزى منقوص الأكسجين في هذه الدراسة إلا أن خروج أنزيمي الليسوزومات، اللذين يكسران الأحماض النووية إلى السيتوبلازم (تحت تأثير الكحول الأثيلي) بسبب تحللا في الحوامض النووية وبصورة غير مباشرة فإنه يؤدي إلى نقص في بناء البروتينات .
وختاما فإنه يمكن الاستنتاج من نتائج في هذه الدراسة أن النقص في بناء البروتينات نتيجة إضافة الكحول الأثيلي قد يكون أحد العوامل التي تتلف الاتزان في خلايا الكبد وبالتالي فإن هذا يؤدي إلى إتلاف الكبد. وكذلك تبين أن الكحول الأثيلي يؤثر على خلايا الكبد مباشرة بالإضافة إلى تأثيره عن طريق مشتقه أسيتالدهايد .
